細胞復蘇的原則
快速融化:必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃,使細胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化,避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細胞形成再結晶,對細胞造成損害。
一. 實(shí)驗前準備:
1.將水浴鍋預熱至37℃
2.用75%酒精擦拭紫外線(xiàn)照射30min的超凈工作臺臺面。
3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、吸管、培養瓶等。
二.取出凍存管:
1.根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。
2.從液氮罐中取出細胞盒,取出所需的細胞,同時(shí)核對管外的編號。
三.迅速解凍:
1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的水浴鍋中迅速解凍,并要不斷的搖動(dòng),使管中的液體迅速融化。
2.約1-2min后凍存管內液體溶解,取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁,再拿入超凈臺內。
四.平衡離心:
用架盤(pán)天平平衡后,放入離心機中3000r/min 離心3min
五.制備細胞懸液:
1.吸棄上清液。
2.向離心管內加入10ml培養液,吹打制成細胞懸液。
六.細胞計數:
細胞濃度以5×105/ml為準。
七.培養細胞:
將復合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶?jì)?,將培養瓶放入37℃5%CO2的培養箱內2-4小時(shí)(或者24-48小時(shí))后換液繼續培養培養,換液時(shí)間由細胞情況而定。
特別注意初學(xué)者常犯的錯誤:
1水浴鍋未預熱或者未預熱到37℃。
2.水浴鍋內凍存管太多,導致傳熱不佳,使融化時(shí)間延長(cháng)。
3.離心前忘記平衡,導致離心機損壞和細胞丟失。
4.一次復蘇細胞過(guò)多,忘記更換吸頭和吸管,導致細胞交叉污染。